Cabai merupakan komoditas hortikultura yang penting di Indonesia. Namun produksinya masih belum optimal karena belum banyak tersedia benih unggul, yang menyebabkan rendahnya produktivitas. Salah satu solusi masalah tersebut adalah dengan perbaikan bahan tanam (benih) melalui program pemuliaan tanaman dengan proses persilangan (hibridisasi). Persilangan cabai yang berbeda jenis memerlukan waktu yang tepat untuk dapat meningkatkan peluang keberhasilannya. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efektivitas waktu persilangan tiga genotipe cabai (dua introduksi dan satu lokal). Penelitian dilaksanakan dengan rancangan acak kelompok faktorial, Faktor pertama adalah kombinasi persilangan dari tiga tetua, yaitu Sweet Italian, Garda dan Katokkon secara dialel. Faktor kedua adalah waktu persilangan, yaitu pada pukul 04.00, 05.00, 06.00, 07.00, 08.00. Hasil analisis menunjukkan bahwa kombinasi tetua memiliki interaksi dengan waktu persilangan dalam meningkatkan keberhasilan persilangan. Tiap kombinasi tetua memiliki waktu yang spesifik untuk persilangan. Jika tetua betina Sweet Italian, waktu persilangannya semakin pagi (suhu rendah) semakin optimal, yakni di antara pukul 04.00-07.00. Untuk persilangan KatokkonŨGarda maupun resiproknya, persentase keberhasilan persilangan semakin meningkat jika dilakukan pada pukul 06.00-08.00. Tidak ada penyerbukan silang antara GardaŨSweet Italian yang berhasil persilangan atau seluruhnya letal.